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    如何判斷一只色譜柱的“退休”時間

    點擊次數:2104   發布時間:2018/7/17 8:45:55

    色譜工作者常會碰到這樣的問題,色譜柱的塔板數能體現色譜柱的狀態嗎?如何確定一支色譜柱是否應該“退休”?新的色譜柱在使用前都要做什么?如何對柱子進行清洗?好的色譜柱應具備哪些性能?等等一系列問題,都是今天小析姐要和您探討的!
    新色譜柱開啟和安裝推薦步驟
     
    1.使用新鮮潔凈的水與乙腈。沖洗系統,確保系統干凈,不含任何緩沖鹽和污染物。
    2.取用色譜柱時避免磕碰掉落。
    3.將色譜柱入口端連接到系統上,柱出口端先不要連接,色譜柱身上有箭頭標明正確流向。
    4.在0.1mL/min流速條件下用純乙腈潤洗色譜柱,然后在2分鐘內將流速升至0.5mL/min。
    5.當溶劑均勻的從柱出口端流出,停流速,將色譜柱出口端接到系統檢測器上(這樣可以避免氣泡進入檢測系統,并且可快速達到基線平衡)。
    6.重啟流速,按照步驟4的方法逐漸提高流速,至常規分析時所使用的流速。
    7.參考柱效測試報告中的方法,使用該流動相條件平衡色譜柱,通常需要使用5-10倍柱體積的流動相,直至壓力與基線穩定。
    8.測試柱效。如果沒有柱效測試報告中的分析物,請聯系廠家部門尋求支持,使用合適的濃度與進樣量。柱效結果略低于柱效測試報告屬正常情況。如結果明顯偏低、峰形拖尾,提示色譜柱和/或所使用的液相系統處于非理想狀態,需要進行故障排查。當使用2.1mm內徑色譜柱時,建議優化系統以減少譜帶展寬,包括:使用檢測器微量流通池,減少進樣器loop環體積,使用較小內徑(如0.005''或0.12mm)的系統管路。并確保管路與色譜柱連接恰當、無死體積。當使用小顆粒填料(如2.5μm)短柱進行高效快速分離時,
     
    需要考慮以下因素:
    1.確保管路與色譜柱連接恰當、無死體積,盡量優化系統減少譜帶展寬;
    2.提高采樣頻率至10點/秒以上;
    3.較小粒徑的色譜柱產生的柱壓較高,而較小粒徑要達到*優色譜效率所需的線速度較高,請根據所用LC系統的實際情況調節流速;
    4.可使用較高的柱溫來補償小顆粒造成的壓力升高,例如40?C。使用雜化顆粒反相色譜柱時,可使用45?C或更高。
     
    使用反相C18色譜柱總結的一些小經驗
     
    1、新柱的處理:我們每次新買的柱子雖然是經廠家測試過并密封好的,可是有的柱子到達手中時已經過很長的時間了,因此,我們每拿到一根新的色譜柱都必須要對柱子進行處理。首先,是配制好65%的乙腈/水,再把色譜柱正確的連接在色譜儀上,出口放空(注意:出口端切不可連上檢測器,以免污染了檢測器),以低流速0.1ml/min~0.5ml/min(如果是LC/MC柱子,則應以0.3ml/min進行)均可,不可以高流速進行,等看見柱子出口有液體流出后,過20分鐘后再接上檢測器,以循序漸進的方法將流速調至1.0ml/min(如果是LC/MC柱子則應以0.3ml/min進行),繼續沖洗2~8小時。
     
    2、新柱的使用:首先我們確認所分析樣品流動相的PH是不是在色譜柱PH的耐受范圍之內,以免損傷柱子!如果,確認在柱子的使用范圍之內,就用做樣品的流動相平衡柱子(如果流動相中含用緩沖鹽溶液,在平衡柱子之前務必要先用5%甲醇或5%乙腈去過渡30分鐘以上。再用帶鹽的流動相去平衡色譜柱。)當色譜柱平衡了足夠時間,基線非常平穩的時候,方可進樣分析。不管是分析什么樣的產品,由于各種各樣的因素,樣品中總有雜質。因此,在色譜柱前端加上保護柱。以增加色譜柱的使用壽命!
     
    3、色譜柱清洗:①如果樣品分析中只用到一般的乙腈、甲醇和水的流動相,在做完樣品之后可直接用55%~65%乙腈/水或者用55%~65%甲醇/水沖洗色譜柱40~80分鐘,然后以純甲醇或乙腈沖洗30分鐘,即可保存;②如果樣品分中流動相里含用緩沖液或酸或離子對試劑的流動相,在做完樣品之后的清洗必須按照如下步驟進行清洗柱子:先用5%的甲醇/水或5%的乙腈/水,以1ml/min,沖洗1.5小時以上(如果色譜柱更長,則還需要增加適當時間);然后用55%甲醇/~水65%/水沖洗色譜柱30~60分鐘.*后用甲醇或乙腈以1ml/min沖洗30分鐘。
     
    4、色譜柱的再生:當色譜柱用過很長的時間之后,就可能發生柱壓力升高、分離度不好、柱效降低、峰形不好等等情況,這時我樣就需要對色譜柱進行再生,以延長色譜柱的使用壽命。具體方法有如下兩種:①先用5%甲醇/水或者是5%乙腈/水,把色譜柱反向以1ml/min,沖洗60分鐘以上.然后用四氫呋喃以1ml/min沖洗30分鐘以上;再用65%甲醇/水或者65乙腈/水,以流速1ml/min沖洗60分鐘。*后用純甲醇或乙腈沖洗30分鐘保存即可。 備注:甲醇、乙腈、四氫呋喃均要用質量好色譜純。水用是重蒸留水。
     
    什么時候該換新柱了?
     
    1.當柱子塔板數降低到新柱子百分之幾時該換?
    色譜工作者常會碰到這樣的問題,什么時候該換色譜柱了?色譜柱的塔板數能體現色譜柱的狀態嗎?確定表明一支色譜柱應該“退休”的標準,從經驗來看,當一支色譜柱的塔板數降低到新柱子時的百分之多少時就可以認為該色譜柱不能再使用了呢?將塔板數作為評價色譜柱質量的指標合適嗎?在您的實驗室里是如何判斷一根色譜柱不可以再用了呢?
    塔板數是一個粗略的指標,不能作為評價色譜柱的標準。通常使用塔板數來考察色譜系統:將新柱子接到儀器上,根據色譜柱生產商提供的測試條件測試該色譜柱,你應該得到和分析報告上同樣的結果。*差也應該得到比報告值低10%的塔板數。如果你所測得的塔板數遠遠低于廠家提供的報告數據,這就說明你的色譜系統可能存在一些問題。進樣器、柱外效應、毛細連接以及檢測器都是容易出現問題的地方。
     
    2.使用壓力、分辨率和峰形的混合指標來考察一根色譜柱的狀態
    相信每個色譜工作者都會關心分辨率,分辨率是考察一根色譜柱分離具體樣品的好壞程度指標。 然而,我們需要考慮的另一個因素是塔板數對分辨率的影響僅僅是平方根的關系,這意味著當一根色譜柱的塔板數下降50%,分辨率僅僅下降7%。而當一根色譜柱塔板數下降為新柱子一半的時候,你肯定看到了其它更加嚴重的癥狀告訴你這根色譜柱的壽命不長了。在實際的工作中,大多數色譜方法僅僅需要這些塔板數的一半,這些色譜方法還有優化的空間嗎?答案是肯定的?梢,色譜柱的塔板數不是分離中*重要的參數。
     
    較好的方法是使用壓力、分辨率和峰形的混合指標來考察一根色譜柱的狀態。
    (1).壓力的測量:是*容易的,通常我們確定的色譜方法要滿足以下的要求:用新柱子時柱壓不高于2500psi,在任何情況下壓力都不超過3000psi。盡管現代的液相色譜系統都可在更高的壓力下使用,但由于高壓產生的系統損耗和泄漏的問題會很嚴重。當壓力超過3000psi時,考慮更換進樣器和色譜柱之間的0.5mm孔徑的在線濾片。如果更換濾片后壓力仍然高,則色譜柱的濾片或者是色譜柱已經被污染,這提示我們該換柱子了。有統計表明,超過60%的色譜柱損壞是由于壓力過高的原因。
     
    (2).分辨率:是我們考察色譜柱的一個非常重要的指標,只要兩個組分可以獲得基線分離,對該分析物的定量就不會有什么問題。對于對稱的高斯峰來講,1.5的分辨率即可得到基線分離;若Rs在1.7至2.0之間則更好。若峰拖尾嚴重則需要更高的分辨率。使用分辨率作為色譜柱的評價指標的好處在于我們可以直觀地看到相鄰的峰的分離情況。
     
    (3)峰形拖尾:另:一個考察色譜柱質量的標準是峰形拖尾情況,廠家測試報告的峰形都非常漂亮,但這并不代表該色譜柱分析實際樣品的情況。實際樣品中總是含有或多或少引起峰形拖尾的組分。*值得一提的是含有氮原子的化合物,這些化合物和硅膠骨架上的游離硅羥基結合非常緊密,隨著色譜柱使用時間越長,鍵合相流失,拖尾則更加嚴重。然而拖尾情況的改變不像分辨率的改變那樣能夠馬上看出來;诖,定一個拖尾因子的上限,如美國藥典規定拖尾因子不超過1.8。
     
    3.確定色譜柱“拋棄”標準*佳時間
    確定色譜柱“拋棄”標準的*佳時間是當我們開發分析方法或作方法認證的時候。通常,在開發分析方法的過程中你會試驗幾根色譜柱,分析足夠多的實際樣品,你知道當分離變差的時候是什么樣的情況。我傾向于在開始時使用一個寬的范圍。我們的經驗是這樣的:你如果在開始時緊縮系統適用性要求,在方法認證后再放寬這個要求是很困難的。在分析實際樣品之前進行系統適用性考察,以確保該色譜方法滿足分析者可以接受的標準。
     
    那么,好的色譜柱應該具備的性能有哪些?
     

     
    網友經驗談:新買的C18色譜柱用前該如何處理?
     
    首先用甲醇或乙腈沖洗,大約20倍柱體積,除新柱子中的有機雜質。然后用10%甲醇或乙腈沖洗10倍柱體積(相比較而言,乙腈價格比甲醇貴,所以一般用甲醇沖洗,大約4小時就可以了)。進行流動相過度,然后就可以運行你的流動相體系了。用完之后,如果流動相中有緩沖鹽,要用10%甲醇沖洗20倍柱體積,如果長期不用,保存在出場溶劑中,短期不用,不用處理,密封后柱子就OK了。
    如果馬上就用,(1)使用的流動相中有緩沖鹽,需用一定百分比的甲醇(如:10%甲醇)沖洗半小時,進行流動相過度,然后就可以運行你的流動相體系了;(2)使用的流動相無緩沖鹽,如甲醇-水(1:1),可直接換流動相,待基線平穩后可直接進樣。
     
    網友經驗談:新柱子要充分平衡
     
    反相色譜柱在經過出廠測試后是保存在乙腈-水中的;由于色譜柱在儲存或運輸過程中固定相可能會干掉,影起鍵合相的空間結構發生變化。因此新柱子要充分平衡。
     
    反相色譜柱的平衡方法:
    1.以乙腈或甲醇(是色譜純的)為流動相,流速:0.2mL/min 沖一夜(小流速過夜沖就行)。
    2.流速改為0.8mL/min 沖上30min直到基線水平為止(正常流速沖)。
    3.使用時替換成流動相沖基線平了就可以用了。
    正相:改用正庚烷或正己烷。(同同反相)以上均為硅膠鍵合相色譜柱!

    原創作者:圣賓儀器科技(上海)有限公司

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