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    三個保護步驟教你如何延長色譜柱壽命

    點擊次數:1694   發布時間:2018/7/11 8:49:53

    三個保護步驟教你如何延長色譜柱壽命
    讓你的柱子永遠不壞?
    沒那么夸張,但是可以使柱子不那么快就壞。
     
    有時候你會發現好像你用了大部分的實驗室經費在不停的買液相色譜柱。為什么色譜廠家不能把柱子的壽命延長一些呢?實際上,在合理的維護下,柱子可以成為液相分析花費里面很小的一部分。舉一個例子,一根典型的反相柱子的花銷在3405-4087元之間, 如果它能進樣500-1000次,那么每一次進樣的花費是3.4-6.8塊錢。
     
    盡管費用會隨著實驗室和特定方法不同而變化,完成一次常規的進樣分析,340塊錢的總費用是合理的,這也可由做委托檢測業務的第三方實驗室對類似分析的定價所確認。
     
    因此,我們上面談到色譜柱的花費在總分析成本中只占1-2%,我們想方設法使柱子的壽命延長一倍,即使單根柱子的成本還是很高,實際上這樣做并不能在整個分析成本上降低很多。我自己個人的感覺是如果你用一根柱子進了500針,那這樣就已經很劃算了。
     
    什么是合理的期望值?
     
    首先,先看一下其他幾個色譜學家的經驗。 Ron Majors,在他的“色譜柱觀察”專欄的某期連載文章中,已經包含了針對色譜各個方面的用戶調查結果。他有關色譜柱壽命的大部分專欄文章是在2012年發表的,將作為我們目前討論的基礎。圖1是基于Ron Majors 2011年用戶調查數據的餅型圖。
     
    可以看到有回應的調查對象中接近四分之三的進樣壽命在500針以上,而且有近二分達到了至少 1000次的進樣壽命。這個結果對我來說是非常吃驚的,因為它包含了對所有類型的色譜柱的壽命調查,不僅僅是現代液相中的*吃苦耐勞的用得*多的主力色譜柱,4.6×150mm,5μm反相柱,相對于其它種類色譜柱,它甚至有點刀槍不入的味道。
     
    圖1 分析柱的典型進樣次數。數據基于2011 年調查
     
    為了看清隨著時間變化情況改變的情形,我做了一個1997年到2011年四個調查結果的比較圖,見圖2?梢钥吹接袔讉明顯的趨勢。

    ,我注意到灰柱,灰柱代表的是在柱子損壞之前進樣小于1000次的百分比,從1997年的76%跌倒了2011年的53%;同時有明顯對比的是代表能進樣1000以上的黃柱高度增加很快。在上面我有提到我把進樣500次作為柱子使用壽命的一個平衡點,我們可以發現在柱子壞之前進樣次數達不到500次的用戶的數量明顯下降,從1997年的接近一半到2011的四分。

     
    圖2 在LC柱子損壞之前進樣次數的比較
     
    *后我們可看到,有著可怕經歷的用戶的數量,即那些只能做到100或者更少的進樣次數的用戶,比例基本上沒有改變,徘徊在10%附近。
     
    找出這種改變的原因只能是出于推測,但是我很樂意做此推斷。我不認為柱子壽命有明顯的提升是因為柱子工藝的改進。
     
    不可否認,在某個時期,柱子塌陷,或者是柱床中有空腔形成的情況非常普遍,但是在1997年開展調查的時間段,裝柱工藝就已經非常成熟了,由于裝柱工藝導致柱子損壞的情況很少見。我認為柱子壽命延長的主要原因是用戶受到更好的培訓,從而對樣品前處理和柱子的物理保護更好了。
     
    柱子的保護方法就是我想在下文著重說明的。我同時也推斷,進樣次數很穩定的小于100,與其說是柱子本身的原因,還不如說是實驗室操作存在問題,或者說是某些應用方法本身就是“柱子終結者”。
     
    不要未處理樣品就進樣
     
    在我的LC課堂中,我經常開玩笑的說,延長柱子壽命的方法是不要打開色譜柱的盒子。一旦你開始進樣,就開始了柱子走向滅亡的道路。樣品有兩個主要方面可以影響色譜柱—化學性質和物理性質。我們把樣品中不要的化學污染物和微型顆粒清除的越好,柱子的壽命就越長。

    使用SPE(Solide-Phase extraction),液液萃取和其他技術來除去化學污染物是LCGC中“Sample Prep Perspectives”專欄常有這樣的文章,我就不在這里多說了。一言以蔽之,越多的樣品前處理,越少的化學污染物進入色譜柱,柱子壽命就越長。你還得平衡一下樣品前處理費用和它帶來的好處。
     
    比如,你買了柱芯和試劑,并加上你投入時間的費用,你在每個樣品上SPE的花費會很容易超過34塊錢,這是可以承受500次進樣量的反相柱在每個樣品分析上分攤成本的5倍多,這差不多需要將色譜柱進樣次數從500次延長至2500次才扯平了。
     
    另一方面,如果沒有做過任何處理的血漿樣品直接進樣了,柱子可能就只能進樣10次左右。你也要考慮到當更多的樣品處理步驟加入的時候的數據質量。我知道,在我們的實驗室中,這些措施可以讓我們在低濃度的時候收集到有用的數據并得到一致的結果,而不是比較少的前處理步驟可能得到的結果。
     
    不論你做沒做其他前處理步驟,幾乎所有的樣品都會從樣品過濾,離心或者兩者中得到好處。樣品經過一個一次性的過濾膜過濾來移除可能堵住柱子進口篩板的細顆粒物。濾膜的孔徑不能大于柱子進口篩板的孔徑。

    大部分>3μm填料顆粒的柱子用2μm孔徑的篩板,3μm填料粒徑的柱子則一般用0.5μm的篩板,填料粒徑<3-μm的柱子,比如UHPLC,一般用0.2μm的進口篩板。*常用的樣品過濾膜是0.45μm孔徑的,這個對除了亞2μm之外的其它柱子都已經足夠,亞2μm柱子,則需用0.2μm的濾膜。
     
    濾膜可作為預裝在一次性注射器中的柱芯,也作為96孔板的過濾板。即使這些過濾裝置一般是有效的,但我不是非常強烈的推薦使用。至少有4點使我不同意過濾樣品。
     
    ,樣品過濾成本比較昂貴,上一次我比較過價格,一次性購買1000份,每份的價格都要高于3.4元,這個與柱子在每次分析中的分攤費用幾乎一樣。

    第二,用0.5μm濾膜過濾很慢,而0.2μm濾膜則更慢。

    第三,如果你在一個監管嚴格的環境中工作,每一個樣品的處理步驟都必須一樣,這就是說,如果你過濾了一個樣品,那么其他剩余的樣品也都要過濾,無論實際上需不需要。

    *后,如果你要驗證你的LC方法,就需要驗證所有的過濾步驟。在過濾的過程中,樣品會有損失——如果50μL樣品經過濾膜,得到的樣品就少于50μL。
     
    你得證明樣品不是選擇性的損失,特別是在高濃度或者低濃度的時候。因此,我們可以看到,樣品過濾是需要花很多功夫和金錢的。但是你要是不怕麻煩和不要求成本,樣品過濾是在大部分的情況下都是能提高柱子的壽命的。
     
    樣品過濾的一個替代方法(或者是補充)是在進樣之前離心。這是一個簡單又相對便宜的方法。只要把樣品放進離心管,Eppendorf 離心管或者一個96孔的離心板,再放到小型臺式離心機里,調整轉速到其速度,旋轉5-10min。
     
    這會使會引起篩板堵塞的顆粒沉積到樣品瓶的底部,然后把樣品轉移到進樣瓶或板中繼續進行分析。這種技術我們在實驗室中對需要沉淀蛋白質的樣品中已經使用了很多年,而且極少出現顆粒物質相關的問題。
     
    我曾經見過這樣的例子,用0.2μm的濾膜過濾之后的樣品,UHPLC進樣,這種樣品還是有一點渾濁并且引起了柱子堵塞,但是這個些微渾濁的樣品離心至澄清之后,柱子堵塞的情況就會減少很多。
     
    使用在線過濾器
     
    我非常認同一個在線的過濾器是LC或者UHPLC中使用成本的附加裝置,可以提供的投資回報。這種過濾器是一個非常簡單的改裝管配件,其中包含了一個特定孔徑的篩板,安裝在自動進樣器和柱子(保護柱,如果用到的話)之間。
     
    現在*普遍的裝置是一個直徑接近37.5px,長度62.5px不銹鋼配件,其中包含一個0.5或者0.2μm孔徑的可替換的篩板。另外一種裝置是包含相同孔徑大小篩板的PEEK手緊配件。這種PEEK過濾器整體是一次性的,但是因為它比不銹鋼過濾器中的一次性使用的篩板要貴,使用成本會比較昂貴。
     
    這種在線過濾器孔徑會選擇比柱子篩板孔徑小一點,因此它會在柱子堵塞之前先被堵塞。當系統壓力開始增加的時候,你就知道在線過濾器中篩板已經開始堵了,需要在完全堵住之前替換掉。
     
    在線過濾器可以起到單獨的樣品過濾器一樣的功能,但在樣品前處理時,不需要額外的人力工作。如果你樣品離心了,偶爾有一些顆粒沒有過濾掉,也會被下游的在線過濾器攔截住。

    在線過濾器的另一優點是它能夠很便捷的更換——如果你動手能力強,在5min內你可以關掉泵、替換篩板、打開系統并繼續實驗。
     
    你可能想要重新進一針系統適應性樣品來檢查一下系統有沒有出問題,使用在線過濾器不需要大量的調節和校準,而這些在更換保護柱時都需要重新做過。在線過濾器的*后一個好處是可以過濾掉泵密封件和進樣閥因磨損產生的顆粒物。我強烈建議在每一個LC系統中都安裝一個在線過濾器,即使你已經在使用保護柱了。
     
    保護柱
     
    保護柱(也叫做預柱)是一種很短的裝在分析柱上游的色譜柱。這種柱子長度一般為10-20mm,包含與分析柱一樣的填料,使用不大于分析柱篩板孔徑的入口篩板和出口篩板。
     
    保護柱有雙重功能,,入口篩板攔截可能堵塞分析柱的顆粒物,第二,填料與分析柱相同,它可以捕抓住那些可能會強烈或者不可逆附著在分析柱填料上的物質?偹苤,保護柱會延長分析柱的壽命,然而,保護柱有幾個潛在的問題。
     
    ,他們比較貴——價格高出分析柱的40%甚至更多,考慮到增加的成本時,你柱子的壽命是否有足夠的延長?
     
    第二,保護柱到底能持續多長時間?你得知道更換柱子的時間,在保護柱上的化學污染物積累太多之前,就要想辦法避免污染物進入到分析柱中。因此,需要對進樣次數計數或者做一個系統適應性實驗來決定什么時候更換保護柱。
     
    第三,你要判斷怎么來清洗保護柱。為了防止把污染物沖洗到分析柱中,保護柱和分析柱需要分開來清洗嗎?
     
    *后,你可能期望將一個20mm長的保護柱加裝到150mm長的分析柱上,使柱效提高10%,但是這種情況很少出現。原因是接入一根保護柱后,系統管路中會增加兩個柱頭連接件和一段管路,而且保護柱沒有分析柱裝柱那么容易安裝,以上兩個方面都會降低系統性能。結果就是如果你運氣好的話,你會得到一樣的理論塔板數,但常見的情況是柱效會稍有降低。
      
    要不要用保護柱的選擇權在你。保護柱確實能延長分析柱的壽命,但是我個人認為在大多數情況下,這并不值得。

    如果你選擇使用保護柱,我還是推薦在自動進樣器和保護柱之間連接使用一個在線過濾器。過濾器的錢只有保護柱的零頭,它還能延長保護柱的使用壽命,就像它能延長分析柱壽命一樣。
     
    總結
     
    盡管你不能讓你的分析柱壽命無限延長,但還是能用一些非常簡單的方法來延長色譜柱這個系統中比較昂貴部件的壽命。
     
    首先,按照要求對樣品進行前處理。樣品前處理的*后一步必須是過濾或者離心。其次,使用在線過濾器來保護保護柱和分析柱,免于被樣品中或者系統其它部分產生的顆粒物堵塞。再次,如果保護柱對你的應用有意義的話,則使用保護柱來保護分析柱。*后,在每批樣品分析之后,使用強溶劑來沖洗柱子,除去在柱子上的任何強保留物質。
     
    此文章主要是針對柱子污染問題,但色譜柱壽命也取決于檢測品種的方法耐用性,如果是難度很大的項目, 譬如化學藥品有多個有關物質測定,或中藥的指紋譜圖,往往方法耐用性 (robustness)較差,柱子壽命也會受到影響。挑選不同選擇性的色譜柱來改善分離度是提高方法耐用性的*佳選擇。
     

    原創作者:圣賓儀器科技(上海)有限公司

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